酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，用于定量或定性分析生物樣本中的特定抗原或抗體。ELISA基于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過酶催化底物顯色來檢測待測物。實(shí)驗(yàn)中，已知的抗原或抗體被固定在固相載體上，然后加入含有待測物的樣本，以及酶標(biāo)記的抗體或抗原。通過加入顯色劑，酶催化底物產(chǎn)生顏色變化，顏色的深淺與待測物的濃度成正比，通過酶標(biāo)儀測定吸光度（OD值）來反映結(jié)果。
ELISA實(shí)驗(yàn)樣本有血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、尿液、唾液、腦脊液等。不同的樣本類型有不同的處理方法。
1、血清:
指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白原已被除去的血漿。
血清是 ELISA 實(shí)驗(yàn)常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡單。
使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置 2 小時或 4℃過夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來）。4℃下以1000×g 離心 20 分鐘，小心收集上清液（血清），立即進(jìn)行測定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA 實(shí)驗(yàn)中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。
2. 血漿:
是離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細(xì)胞成分的液體。血漿與血清的主要區(qū)別在于血漿中含有纖維蛋白。
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后 30 分鐘內(nèi)，4℃下以 1000×g離心 15 分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括 EDTA(部分酶相關(guān)指標(biāo)不建議使用），肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細(xì)閱讀 ELISA 試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:
含有細(xì)胞分泌蛋白和死細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以 1000×g 離心 20 分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細(xì)胞裂解液:
經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后的細(xì)胞溶液。
（1）吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。 懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。
（2）將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，以 1000×g 離心 10 分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞 3 次。
（3）加入適量的預(yù)冷 PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。在 6 孔培養(yǎng)板中，每個孔 需要 150-250μL 的 PBS 來重懸細(xì)胞。
（4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細(xì)胞全裂解。也可 以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細(xì)胞。
（5） 4℃下以 10,000×g 離心 10 分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
（1） 用預(yù)冷的 PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)。
（2） 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
（3） 加入適量的預(yù)冷 PBS（體積取決于組織的重量，9 mL PBS 適用于 1 g 組織，建議使用前立即在 PBS 中加入適量蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。
（4） 將勻漿液吸入離心管中，4℃ 下以 5000×g 離心 5~10 分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃， 避免反復(fù)凍融。
一般來說，由于 ELISA 實(shí)驗(yàn)只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性， -20℃或-80℃保存的樣本應(yīng)在 1-6個月內(nèi)完成檢測，4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測。
