ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣，HRP即辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的質量有重要影響。辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）的顯色原理基于其酶催化作用（氧化作用）。HRP酶標二抗，即辣根過氧化物酶標記的二抗，是生物學實驗常規用的二抗。其特點包括比活性高、穩定性好、分子量小、純酶容易制備等，因此在免疫學實驗中廣泛應用。HRP底物主要包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。
一、二氨基聯苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產生強烈的棕色產物，在水和醇中不溶解。多數情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩定。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣。
1. 需要的溶液和特殊設備
DAB，0.05 mol／LTris緩沖液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30％過氧化氫, DPX, 光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果).
2. 操作步驟
(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB；
(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代)；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫。過氧化氫一般以30％的溶液提供，貯存在4 ℃，此條件可以持續1個月；
(4) 如果出現沉淀，用濾紙過濾；
(5) 加此溶液至標本，并孵育1~20 min水洗終止反應；
(6) 優化：如果需要可復染；
(7) 用DPX封片。
二、氯萘酚
氯萘酚可以形成一種藍黑色產物。敏感性低于DAB，且產物可溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產物的顏色。
1. 需要的溶液和特殊設備
0.03％氯萘酚，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，過氧化氫，Gelvatol或者Mowiol，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2. 操作步驟
(1) 氯萘酚貯存液的準備：用10 mL無水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，貯存于-20℃；
(2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1個月；
(4) 白色沉淀可用濾紙過濾去除；
(5) 加此溶液到標本中，并在室溫孵育10～40 min，水洗終止反應；
(6) 優化：如果需要，進行復染，但只可使用水溶性染料；
(7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。
三、氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反應產生較高背景或要求改變產物顏色的實驗。此產物可溶于醇，但不溶于水。
1. 需要的溶液和特殊設備
0.4％ AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解， 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，過氧化氫， Gelvatol或Mowiol，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2. 操作步驟
(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC。AEC在DMF中穩定，因此，可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用；
(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中，并攪拌；
(3) 加0.15 mL 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1個月；
(4) 用濾紙過濾；
(5) 加此溶液到標本中，并于室溫孵育10～40 min，水洗終止反應；
(6) 優化：如果需要復染，只可用水溶性染料；
(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。
