閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號(hào)大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號(hào)被認(rèn)為是真實(shí)的信號(hào)，用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線不同，進(jìn)而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對(duì)穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會(huì)存在差異。
為什么要有Ct值？
? 模板量與Ct值的關(guān)系：
在PCR指數(shù)擴(kuò)增過程當(dāng)中，產(chǎn)物量與循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)。
? Ct值的設(shè)定：
qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量是以熒光信號(hào)的形式直接呈現(xiàn)，也就是擴(kuò)增曲線。在擴(kuò)增過程當(dāng)中，設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)值，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到“一定產(chǎn)物量”時(shí)（即達(dá)到此熒光閾值時(shí)），此時(shí)循環(huán)數(shù)定義為Ct值，需要注意的是，Ct值需要處于指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期。因此Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。
? Ct值的重現(xiàn)性
Ct值是熒光定量PCR最重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式，用于基因表達(dá)量差異或基因拷貝數(shù)的結(jié)果計(jì)算。一般情況下，復(fù)孔Ct值的差值最好不超過0.05，不然表明誤差結(jié)果太大，結(jié)果不可信。在PCR早期，擴(kuò)增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯的區(qū)別；之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期，此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
1、與Ct值有關(guān)的參數(shù)
標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。
相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，通常要求>0.99。
擴(kuò)增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴(kuò)增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當(dāng)擴(kuò)增效率為100%時(shí)斜率為-3.32，當(dāng)90%-110%時(shí)的斜率為-3.58 ~ -3.10。
2、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系
理想情況下，qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴(kuò)增效率E）^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無法達(dá)到100%，并且在擴(kuò)增的后期，擴(kuò)增效率會(huì)逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知濃度樣品同時(shí)擴(kuò)增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時(shí)，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)品的量值需要準(zhǔn)確可靠。用qPCR進(jìn)行定量，理論上可行，實(shí)際上很難獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。
3、Ct值異常的原因與解決方案
