ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行，有的同行可能會(huì)認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時(shí)便可以萬事大吉了，其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為先進(jìn)的酶標(biāo)儀器儀表，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會(huì)得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測(cè)定后，有許多陰性測(cè)定孔的吸光度值為負(fù)數(shù)或測(cè)定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。
在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。 比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔)，以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。
其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。
比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度(oplical density，OD)，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence，A)，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
此處，只是強(qiáng)調(diào)下面兩點(diǎn)：
1、比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)，以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。
2、單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)比色功能。
所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長(zhǎng)比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測(cè)定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。
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